Таргетное секвенирование позволяет сосредоточиться на конкретных областях генома или отдельных генах. Этот метод применяется тогда, когда у пациента есть подозрение на какое либо генетическое заболевание с известной молекулярной этиологией. В таких случаях достаточно установить структуру только одного гена или некоторых его участков, так называемых горячих точек, где наличие мутации наиболее вероятно.
Для таргетного секвенирования используется обычно метод СЭНГЕРА, который позволяет установить последоваельность небольших фрагментов ДНК - до 1000 нуклеотидов в одном исследовании. Этот метод вполне подходит для анализа одного или нескольких небольших генов.
|
В основе метода Сэнгера автоматического секвенирования лежит уже метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих динуклеотидов. Автоматическое секвенирование включает несколько стадий:
1. Амплифицирование - получение большого количества копий ДНК с помошью специфических олигонуклеотидов - праймеров и фермента - TAq -полимеразы.
2. Специфическая терминация синтеза, которая обеспечивается добавлением в реакционную смесь четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы
3. Разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных.
Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам:
Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке.
|
Капиллярный секвенатор в лаборатории
Результаты секвенирования гена MECP2
Секвенирование кДНК или отдельных экзонов наиболее эффективный способ выявления мутаций. Довольно часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Для генов, имеющих сравнительно небольшие размеры (например, ген фактора IX свертывания крови, детерминирующий гемофилию В), метод прямого секвенирования иногда используют как основной метод сканирования мутаций.
Однако, несмотря на наличие методик (различные модификации ПЦР, использование мРНКлля для получения кДНК), переводящих секвенирование в разряд рутинных методов, секвенирование полноразмерной кДНК (т.е. всех экзонов) для выявления мутаций у отдельных индивидов остается трудоемкой, дорогой и требующей больших затрат времени процедурой. Поэтому на практике полученные путем амплификации или клонирования фрагменты ДНК предварительно тестируют на наличие мутаций более простыми методами, основанными на сравнении физико-химических характеристик мутантных и нормальных последовательностей. Однако точные молекулярные характеристики каждой мутации независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации, инсерции и др.), могут быть получены только путем прямого секвенирования.
Преимущества таргетного секвенирования
- Позволяет сфокусироваться на определённых участках, благодаря чему анализировать результат гораздо удобней;
- Существенно снижает затраты (временные и денежные);
- Благодаря глубокому секвенированию на различных уровнях можно получить информацию о редких отклонениях.
Доступность метода
По сравнению с комплексными методами анализа, таргетное секвенирование более выгодно. Исследуются лишь отдельные участки генов, в которых могут определяться мутации. В таком случае для диагностики требуется меньше ресурсов, поэтому таргетный поиск отдельных отклонений обойдётся гораздо дешевле, нежели полная диагностика.