Медицинский центр «Геномед»
Бесплатная горячая линия:
8-800-333-45-38
Заказать обратный звонок
Медико-генетический центр
лаборатория молекулярной патологии
Все контакты
Ваше имя*  
Сообщение  
Ваш телефон  
Ваш e-mail  
 
Адрес:
г.Москва, Подольское шоссе,
дом 8, корпус 5 (метро Тульская)
График работы:
Пн.-Пт.: с 8.00 до 19.00
Сб.: с 8.00 до 17.00
Вс.: с 8.00 до 15.00
Лицензия № ЛО-77-01-010099 от 21 апреля 2015 г Квитанция на оплату, вышестоящие огранизации Правила предоставления платных мед. услуг.
8 (495) 660-83-77 Обратный звонок
Дизайн и разработка сайта
"Сайт-консалтинг"


Яндекс.Метрика
© 2015 - Геномед - медико-генетический центр

Таргетное секвенирование


     Таргетное секвенирование позволяет состредоточится на конкретных областях генома или отдельных генов. Этот метод применяется тогда, когда у пациента есть подозрение на какое либо генетическое заболевание для которого известны гены или конкретные мутации. В таких случаях нет необходимости исследовать все гены, а достаточно установить структуру только одного гена или некоторых его участков, так называемых горячих точек, где наличие мутации наиболее вероятно. 

 

     Для таргетного секвенирования используется обычно метод СЭНГЕРА, который позволяет установить последоваельность небольших фрагментов ДНК - до 1000 нуклеотидов в одном исследовании. Этот метод вполне подходит для анализа одного или нескольких небольших генов.

 

 

     

    В основе метода Сэнгера автоматического секвенирования лежит уже  метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих динуклеотидов. Автоматическое секвенирование включает несколько стадий:

     

    1. Амплифицирование (получение большого количества копий) необходимого для анализа фрагмента ДНК с помошью специфических олигонуклеотидов - праймеров и  фермента - TAq -полимеразы.

     

    2. Специфическая терминация синтеза, которая обеспечивается добавлением в реакционную смесь четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы

     

    3. Разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных.

     

    Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке.

     

            

         Капиллярный секвенатор в лаборатории                      Результаты секвенирования гена MECP2

 

    

      Секвенирование кДНК или отдельных экзонов  наиболее эффективный способ выявления мутаций. Довольно часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Для генов, имеющих сравнительно небольшие размеры (например, ген фактора IX свертывания крови, детерминирующий гемофилию В), метод прямого секвенирования иногда используют как основной метод сканирования мутаций.

 

    Однако, несмотря на наличие методик (различные модификации ПЦР, использование мРНКлля получения кДНК), переводящих секвенирование в разряд рутинных методов, секвенирование полноразмерной кДНК (т.е. всех экзонов) для выявления мутаций у отдельных индивидов остается трудоемкой, дорогой и требующей больших затрат времени процедурой. Поэтому на практике полученные путем амплификации или клонирования фрагменты ДНК предварительно тестируют на наличие мутаций более простыми методами, основанными на сравнении физико-химических характеристик мутантных и нормальных последовательностей. Однако точные молекулярные характеристики каждой мутации независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации, инсерции и др.), могут быть получены только путем прямого секвенирования.