Изменения и эффективность показаний к инвазивной пренатальной диагностике хромосомных аномалий: 13 лет опыта работы в одном центре

Вводная информация

Инвазивные процедуры – в основном биопсия ворсин хориона (БВХ) и амниоцентез – очень распространены для пренатальной диагностики. В настоящее время традиционный пренатальный хромосомный анализ, флуоресцентная гибридизация in situ (ФГ in situ) и хросомный микроматричный анализ (ХМА) зависят от образцов, полученных от инвазивных процедур.

Хромосомные аномалии, которые совместимы с жизнью, но вызывают значительные патологические проявления, проявляются у 0,65% новорожденных, а очевидно сбалансированные структурные хромосомные перестройки, которые в конечном итоге влияют на репродуктивные функции, проявляются у 0,2% новорожденных. Применение ХМА или анализа одиночных нуклеотидных полиморфизмов (СНИП) позволило обнаружить субмикроскопические аномалии и геномные нарушения. Наиболее часто встречающиеся рецидивные геномные нарушения встречаются примерно у 0,18% новорожденных. В 2009 году Американский колледж акушеров-гинекологов рекомендовал использование традиционного определения кариотипа в качестве основного цитогенетического инструмента при пренатальной диагностике, а ХМА в качестве дополнения к наблюдению за беременными женщинами с аномальными результатами УЗИ и нормальным традиционным кариотипом.

Однако многие факторы, такие как риск того, что у плода проявится хромосомная аномалия по причине прямой ультразвуковой визуализации плода и косвенных маркеров материнской сыворотки, риск связанного с процедурой выкидыша, последствия рождения ребенка с нарушениями, беспокойство, этническое происхождение и религиозные взгляды могут повлиять на решение беременной женщины принять или отклонить инвазивную процедуру.

Ожидается, что в будущем применение скрининга внеклеточной ДНК плода для обнаружения цитогенетических нарушений значительно улучшит диагностическую значимость и снизит количество ненужных инвазивных процедур. Таким образом, настало время обобщить клинические показания инвазивной пренатальной диагностики. Кроме того, скрининг внеклеточной ДНК имеет множество ограничений, и многие хомосомные аномалии, включая хромосомные структурные аномалии и геномные аномалии, не могут быть подвергнуты скринингу. Таким образом, клинические показания, точно прогнозирующие риск цитогеномных аномалий, играют важную роль в пренатальном генетическом консультировании и диагностике.

Использование клинических показаний постоянно изменяется, исходя из временных и региональных различий. Текущие пренатальные клинические показания включают аУЗИ, аномальный скрининг материнской сыворотки (аСМС), поздний возраст матери (ПВМ), семейный анамнез (СА) хромосомных аномалий и другие события, которые могли бы повлиять на здоровье плода.

Ожидается, что пренатальная диагностика будет продвигаться вперед с более эффективными неинвазивными пренатальными показаниями и полногеномным анализом цитогеномных аномалий. Тем не менее, эффективность клинических показаний при пренатальной диагностике может варьироваться в разных условиях врачебной практики и в разных регионах.

Это исследование предназначалось для анализа эффективности показаний ПВХ и амниоцентеза из регионального акушерского отделения. Результаты обеспечивают диагностическую значимость по одиночным или комбинированным клиническим показаниям и указывают, какие женщины нуждаются в инвазивном обследовании и будущем направлении на более тщательную пренатальную диагностику цитогеномных аномалий. Эта информация будет полезна для акушеров, клинических генетиков и лабораторного персонала для дальнейшего улучшения качества пренатальной диагностики.

Материал и методы

Йельская цитогенетическая лаборатория является региональной справочной лабораторией пренатальной диагностики в округе Нью-Хейвен и прилегающих районах. С 2000 по 2012 год лаборатория провела анализ кариотипа на 3229 ПВХ и 4589 образцах околоплодных вод (ОВ) (исключая 17 образцов с неудачным посевом). ФГ in situ с использованием зондов для HIRA-гена при 22q11,21 была выполнена у 55 пациентов с аУЗИ, выявившим порок сердца, или СА с синдромом Ди Джорджи. С 2009 года МСГГ была подтверждена и предлагалась беременным с высоким риском после предварительного консультирования по техническим спецификациям и ограничениям. В качестве дополнительного обследование было проведено в общем 248 ХМА. Все результаты испытаний и клинические показания этих 7818 БВХ и амниоцентезов были собраны в базе данных системы CytoAccess лаборатории.

Клинические показания к пренатальной диагностике включали:

  • БВМ, определенный возрастом, равным или старше 35 лет, для одноплодной беременности, 33 года для близнецов и 31 год для тройни;
  • аУЗИ, выявившее увеличенную толщину воротникового пространства (³3 мм), кистозную гигрому и другие предполагаемые аномалии плода;
  • аСМС при четверном тесте материнской сыворотки во время первого или второго триместра, включая хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), а-фетопротеин (АФП), неконъюгированный эстриол и ингибин А;
  • СА хромосомной аномалии в предыдущей беременности, родители с аномальным кариотипом или анамнез аномального рождения потомства;
  • многоплодная беременность (МБ), включая близнецов и тройни;
  • другие показания, такие как внутриутробная смерть плода или гибель, облучение или воздействие лекарственными препаратами во время беременности, беспокойство и кровный брак.

Из 7818 случаев 68%, 30% и 2% направлялись по одиночному показанию, 2 показаниям и 3 показаниям соответственно. Было зарегистрировано 63 комбинации клинических показаний. Для практических целей для оценки диагностической значимости использовались одиночные и комбинированные показания, содержащиеся в более чем 1% образцов (кроме МБ).

Традиционный анализ хромосом проводился на метафазах G-группы, полученных из культивируемых клеток ОВ и БВХ. Хромосомные аномалии были классифицированы как численные и структурные аномалии. Обследования ФГ in situ с использованием зондов Aneuvision для быстрого скрининга анеуплоидий хромосом X, Y, 21, 13 и 18 и целевых зондов для геномных нарушений проводились по протоколам производителя (Vysis/Abbott, Abbott Park, IL). Геномная ДНК была извлечена из БВХ и культивируемых амниоцитом с использованием набора «Gentra Puregene Kit» (компания «Qiagen», Валенсия, Калифорния).

Анализ олигонуклеотидов ХМА с использованием набора для микроматричного анализа СГГ генома человека Agilent 44K (содержащего 44 913 60-мерных олигонуклеотидов, включая сборку генома человека NCBI36/hg18) и набор 180K (177 873 60-мерных олигонуклеотидов, включая сборку сборку GRCh37/hg19) (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Калифорния) выполнялся, как описано ранее.

Диагностическая значимость была определена как процент аномальных случаев от случаев направления по одиночным, комбинированным или всем показаниям. Анализы регрессии временного ряда были выполнены для дисперсии для оценки значимости тенденций и тестов хиквадрат для сравнения показателей с использованием Пакета программ обработки статистических данных общественных наук (SPSS) для Windows (SPSS Inc. Чикаго, Иллинойс). Для испытаний значимости значение Р менее 0,05 считалось значимым.

Результаты

С 2000 по 2012 год наиболее распространенными показаниями были БВМ, аСМС и аУЗИ. Для случаев БВХ число направлений по БВМ снизилось с 55,8% до 51,1% (P<0,05), число направлений по аСМС возросло с 0,5% до 11,2% (P<0,05), а число направлений по аУЗИ осталось на уровне 10,6±3,3% (Рис. 1A).

Для случаев ОВ число направлений по БВМ значительно снизилось с 55,9% до 35,2% (P<0,001), число направлений по аСМС осталось на уровне 26,8±2,4%, а число направлений по аУЗИ возросло с 5% до 20% (P<0,05) (Рис. 1В).

Показания СА, МБ и другие остались на уровне менее 12,3 (3,1%) и показали относительно стабильную тенденцию, за исключением снижения числа направлений по СА для БВХ. Использование множественных показаний, определяемых средним числом показаний в каждом случае, показало тенденцию к увеличению в течение 13-летнего периода (P<0,01), а направления по БВХ требовали больше показаний, чем по ОВ (P<0,01) (Рис. 1С).

Рисунок 1. ИзмененияпоказанийПВХи амниоцентеза с 2000 по 2012 год в Йельской цитогенетической лаборатории.

(А) Изменения клинических показаний ПВХ.
(В) Изменения клинических показаний амниоцентеза.
(С) Среднегодовое количество показаний за каждый случай.
(D) Количество всех пациентов и аномальных образцов.

Несмотря на то, что годовое количество пациентов БВХ и ОВ показало значительное снижение на 57,2% по сравнению с 853 случаями в 2000 году до 365 случаями в 2012 году (P<0,01), в количестве аномальных результатов существенных изменений не наблюдалось (Рис. 1D). Диагностическая значимость хромосомных аномалий показала значительное увеличение с 7,2% в 2000 году до 13,4% в 2012 году (Р<0,01), а общая диагностическая значимость составила 9,6%.

Клинические показания, связанные с обнаруженными хромосомными аномалиями, также были подсчитаны и упорядочены следующим образом: БВМ 57,6%, аУЗИ 40,3%, аСМС 30,5%, СА 9,6%, МБ 4,8%, другие показатели 2,3%.

Эффективность одиночных или комбинированных показаний для выявления хромосомных аномалий приведена в Таблице 1.

Три самых высоких значения диагностической значимости отмечались в случаях с БВМ/аУЗИ (51,4% для ПВХ, 24,2% для ОВ), аУЗИ (34,7% для БВХ, 14,5% для ОВ) и БВМ/аСМС (17,8% для БВХ, 9,9% для ОВ). В этой группе наиболее эффективным одиночным показанием явилось аУЗИ, затем аСМС или СА, а затем БВМ. МБ был назван показателем пренатальной диагностики согласно нашей региональной практики. Тем не менее, хромосомные аномалии не были обнаружены при направлениях по МП.

Таблица 1. Эффективность показаний при обнаружении хромосомной аномалии.

Клинические показания Количество направлений(%) Аномалия Динамическая значимость*
Все ХА (%) чХА сХА
ПВХ
ПВМ/аУЗИ 142 (1,8) 73 (9,7) 73 0 51,4%
аУЗИ 262 (3,4) 91 (12,1) 85 6 34,7%
ПВМ/аСМС 342 (4,4) 61 (8,1) 57 4 17,8%
аСМС 203 (2,6) 30 (4,0) 28 2 14,8%
СА 207 (2,6) 20 (2,7) 7 13 9,7%
ПВМ/СА 272 (3,5) 25 (3,3) 12 13 9,2%
ПВМ 1242 (15,9) 81 (10,8) 72 9 6,5%
ПВМ/МБ 388 (5,0) 12 (1,6) 8 4 3,1%
МБ 20 (0,3) 0   0 0 0
Другие 151 (1,9) 28 (3,7) 23 5 18,5%
Промежуточный итог** 3229 (41,3) 421 (56) 365 56 13,0%
ОВ
ПВМ/аУЗИ 95 (1,2) 23 (3,1) 20 3 24,2%
аУЗИ 571 (7,3) 83 (11) 68 15 14,5%
ПВМ/аСМС 639 (8,2) 63 (8,4) 58 5 9,9%
Прочее 92 (1,2) 6 (0,8) 3 3 6,5%
СА 111 (1,4) 7 (0,9) 1 6 6,3%
аСМС 823 (10,5) 47 (6,3) 32 15 5,7%
ПВМ/СА 131 (1,7) 6 (0,8) 4 2 4,6%
ПВМ 1782 (22,8) 61 (8,1) 43 18 3,4%
ПВМ/МБ 103 (1,3) 0   0 0 0
МБ 11 (0,1) 0   0 0 0
Другие 231 (3,0) 35 (4,7) 26 9 15,2%
Промежуточный итог 4589 (58,7) 331 (44) 255 76 7,2%
Итого 7818 (100,0) 752 (100,0) 620 132 9,6%

* Диагностическая значимость = все ХА/количество направлений;
** Статистически значимое межгрупповое сравнение (р<0,001) наблюдается при ПВХ;
ХА – хромосомная аномалия;
чХА – численная ХА; сХА – структурная ХА;
ПВХ – проба ворсинчатого хориона;
ОВ – околоплодные
воды;
ПВМ – поздний возраст матери;
аУЗИ – аномальные результаты УЗИ;
аСМС – аномальный скрининг материнской сыворотки;
СА – семейный анамнез;
МБ – многоплодная беременность;
другие – все остальные комбинации, за исключением показаний в таблице.

Обследования ФГ in situ были использованы для определения делеции 22q11.2 в пренатальных случаях с аУЗИ, выявившим порок сердца, или СА с синдромом Ди Георга. Из 55 обследованных случаев в 6 был диагностирован синдром Ди Георга. Предыдущая валидация анализа МСГГ на 11 случаях с выявленными в пренатальном периоде структурными аномалиями успешно выявила геномные дисбалансы и содержание генов.

Анализ МСГГ, проведенный на 237 пренатальных случаях с нормальными хромосомными результатами, выявил 6 патогенных и вероятных патогенных геномных аномалий. Рецидивные геномные нарушения делеций 16p13.11, унаследованных от родителя-носителя, были обнаружены в двух несвязанных семьях, а дублирование 22q11.2 было замечено в 1 случае.

В случаях с рецидивными геномными нарушениями отмечались результаты аУЗИ, выявившие ЗВР, кистозную гигрому, эхогенный кишечник и тетраду Фалло. Клинические показания и геномные аномалии из анализов ФГ in situ и МСГГ показаны в Таблице 2.

Таблица 2. Геномные аномалии, обнаруженные посредством МСГГ и их показания.

№ случая Показания Отбор проб Кариотип Результаты ФГ insitu или МСГГ
Патогенный
1 аУЗИ (тетрада Фалло) ОВ 46,ХХ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)
2 аУЗИ (тетрада Фалло) ОВ 46,ХУ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)
3 аУЗИ (врожденный порок сердца) ОВ 46,ХХ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)
4 аУЗИ (врожденный порок сердца) ОВ 46,ХХ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)
5 аУЗИ (аномалии плода) ОВ 46,ХХ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)
6 СА синдром Ди Георга ОВ 46,ХУ делеция гибридизации in situ (22) (q11.2q11.2)(TUOLE1-)mat
7 аУЗИ (кистозная гигрома, гибель плода) ОВ 46,ХУ [hg18]16p13.11 (14,876,156-16,174,951)x1pat
8 аУЗИ (ЗВР, эхогенный кишечник) ОВ 46,ХУ [hg19]16p13.11 (14,910,205-16,586,915)x1pat
9 аУЗИ (тетра Фалло) ОВ 46,ХХ [hg18]22q11.21 (17,274,635-18,589,433)x3
10 аУЗИ (ЗВР) ОВ 46,ХУ [hg18]Xq25q26,3 (129,092,340-133,914,595) x2dn
Вероятно патогенный
11 аСМС (повышенный риск С.Д.) ПВХ 46,ХУ [hg19]12q24.13 (112,713,491-112,942,507) x3mat
12 аСМС (повышенный риск С.Д.) ОВ 46,ХХ [hg19]Xq28 (154,118,643-154,560,375) x3mat

ФГ insitu– флуоресцентная гибридизация insitu;
МСГГ – матриксная сравнительная геномная гибридизация;
аУЗИ – аномальные результаты УЗИ;
ОВ – околоплодные воды;
ПВХ – проба ворсинчатого хориона;
СА– семейный анамнез;
аСМС – аномальный скрининг материнской сыворотки;
ЗВР – задержка внутриутробного развития;
С.Д. – синдром Дауна.

Варианты неизвестного значения (ВНЗ) были обнаружены в 5 случаях; 2 из них проводились в качестве исследования родителей и были подтверждены как семейные варианты по материнской линии (данные не показаны). Оцененная диагностическая значимость анализов ФГ in situ и МСГГ для геномных аномалий тестируемых пренатальных случаев составила 4% (12/303).

Обсуждение

Наша цитогенетическая лаборатория предоставила пренатальный хромосомный анализ, ФГ in situ и микроматричный анализ для академической больницы Йельского университета со стабильными направлениями из округа Нью-Хейвен и прилегающих районов. В соответствии с предыдущими исследованиями наши данные демонстрировали непрерывную тенденцию к сокращению инвазивных процедур. Снижение количества пациентов и отклонение процедур в значительной степени объяснялись лучшей осведомленностью и более информативным консультированием по клиническим показаниям.

Пересмотренные рекомендации Американского колледжа акушеров-гинекологов по скринингу и инвазивному обследованию от 2007 года рекомендовали доступность генетического скрининга и инвазивного диагностического обследования на анеуплоидию всем беременным женщинам, независимо от возраста матери.

БВМ, известный фактор повышенного риска возникновения синдрома Дауна, попрежнему является одним из ведущих показателей во многих отчетах. В нашей практике БВМ является наиболее распространенным показателем, за которым следует аСМС на втором месте и аУЗИ на третьем месте. Однако с развитием чувствительной ультразвуковой технологии и маркеров материнской сыворотки показание аСМС по БВХ и аУЗИ по ОВ увеличилось с 2000 по 2012 год при значительном снижении БВМ.

Анализ диагностической значимости по одиночным и комбинированным клиническим показаниям может предоставить полезную информацию для консультирования и диагностики по вопросам пренатальной генетики. На одиночные показания по БВХ и ОВ, ПВМ, аСМС, аУЗИ и СА приходилось 39%, 13%, 11% и 4% направлений, а также 19%, 10%, 23% и 4% от общего числа аномальных результатов соответственно. На комбинированные показания по БВМ/аУЗИ, ПВМ/ аСМС и БВМ/СА приходилось 3%, 13% и 5% направлений, а также 13%, 17% и 4% от общего числа аномальных результатов соответственно (Таблица 1).

Было очевидно, что БВМ/ аУЗИ, аУЗИ и ПВМ/аСМС являются наиболее эффективными показаниями, и вместе они составляют 26% от общего числа направлений и 52% от общего числа аномальных результатов. Тем не менее, оставшиеся 48% хромосомных аномалий по причинам других одиночных и комбинированных показаний незаменимы в пренатальной практике. В нынешней группе только 40% случаев выявленных хромосомных аномалий имели результаты аУЗИ, что указывает на отсутствие видимых ультразвуковых структурных аномалий плода примерно у 60% пренатальных хромосомных аномалий. В других группах сообщалось о результатах аУЗИ у 9-30% плодов с хромосомными аномалиями. Дальнейшее продвижение пренатальной ультразвуковой эхографии с лучшей визуализацией и включением мягких маркеров улучшит диагностическую значимость. Тем не менее, у некоторых плодов с хромосомными аномалиями может не быть аномалий, обнаруживаемых посредством УЗИ.

При населении 0,86 млн. человек в округе Нью-Хейвен и 2,17 млн. человек в окрестностях и 1,3% уровне рождаемости, выявленном в результате переписи в Соединенных Штатах в 2012 году, согласно оценкам, каждый год в округе Нью-Хейвен насчитывается 11 180 новорожденных и 27 430 новорожденных в окрестностях. В течение 13 лет в данной пренатальной группе хромосомный анализ выявил 292 плода (в среднем 22 случая в год) с трисомией 21 хромосомы по диагностике синдрома Дауна. ФГ in situ и МСГГ выявили 7 плодов с делециями и дублированиями в области синдрома Ди Георга (0,5 случая в год). Среди общего числа населения частота возникновения синдрома Дауна (OMIM №190685) составляет от 1/650 до 1/1000 живорождений, а частота возникновения синдрома Ди Джорджи (OMIM №188400) составляет 1 из 4000, что указывает на соотношение синдрома Дауна против синдрома Ди Джорджи как 6:1-4:1.

Используя 1/800 случай возникновения синдрома Дауна, пренатальная диагностика 22 плодов предположила ежегодную основу из 17 600 беременных женщин, что может быть перенесено на население в 1,35 млн. человек, состоящее из 0,86 млн. В округе Нью-Хейвен и 23% из 2,17 млн. в окретностях. С той же пропорциональной численностью населения проводимый с 2006 по 2009 гг. постнатальный цитогенетический анализ 1354 пациентов педиатрии выявил 7 случаев с трисомией 21 хромосомы (1,75 случая в год), 13 случаев с делецией 22q11,21 и 3 случая с реципрокным дублированием (4 случая в год). Объединив данные пренатальной и постнатальной статистики, мы обнаружили, что ежегодное выявление 24 случаев синдрома Дауна и 4-5 случаев делеции и дублирования области Ди Джорджи соответствует показателю возникновения и синдрома Дауна против синдрома Ди Джорджи из числа приблизительно 17 600 беременностей.

Это наблюдение показало, что около 92% (22/24) случаев синдрома Дауна, но только лишь 10% (0,5/4-5) случаев делеции и дублирования Ди Джорджи, были обнаружены пренатально в текущих условиях. Более низкая диагностическая значимость геномных нарушений в пренатальной практике, вероятно, объясняется отсутствием чувствительных и специфических клинических показаний.

Мы обнаружили что с 2008 по 2010 год количество инвазивных процедур стало заметно меняться, возможно, по причине того, что с тех пор неинвазивное пренатальное обследование стало более популярным. Недавно был утвержден и быстро интегрирован в пренатальную генетическую оценку метод неинвазивного пренатального скрининга с использованием массивно-параллельного секвенирования внеклеточной ДНК материнской плазмы. Американская коллегия медицинских генетиков издала быстрое положение для этого недавно введенного скрининга на основе внеклеточной ДНК. В настоящее время эта недавно интегрированная процедура продемонстрировала высокую чувствительность и специфичность в обнаружении общих анеуплоидий. Этот прогресс также возобновил усилия по разработке неинвазивной пренатальной диагностики с использованием клеток плода, циркулирующих в крови матери. Дальнейшее улучшение скрининга на основе внеклеточной ДНК для выявления геномного дисбаланса является технически осуществимым и, как ожидается, станет прямым указанием на геномные аномалии при пренатальном консультировании для рекомендации дальнейших инвазивных процедур.

Выводы

С 2000 по 2012 год, с развитием чувствительной ультразвуковой технологии и маркеров материнской сыворотки, показания по аСМС и аУЗИ росли, в то время как показания по БВМ значительно снижались, хотя БВМ является наиболее распространенным показанием. Во многом благодаря такому изменению демонстрировалась непрерывная тенденция к сокращению инвазивных процедур. В течение 13 лет пренатальная оценка с использованием БВМ/ аУЗИ была наиболее эффективной при выявлении хромосомных аномалий, но необходимы более высокие показания для геномных аномалий.

Возникновение хромосомных патологических проявлений, репродуктивных дефектов и общих геномных нарушений у 0,65%, 0,2% и 0,18% новорожденных соответственно показало, что исходный уровень пренатальной цитогенетической диагностики должен быть установлен как минимум как 1%, но, скорее всего, не более 3% беременных женщин, если имеют место другие геномные аномалии и мутации генов. Диагностические пренатальные цитогенетические обследования должны проводиться на 176-528 плодах из числа 17 600 беременностей; в 2012 году количество пациентов в данной лаборатории равно 365 и находится на исходном уровне.

Целью инвазивных процедур пренатальной диагностики является достижение гораздо более высокой диагностической значимости для цитогенетических аномалий. С этой целью пренатальная генетическая оценка с использованием множественных методов скрининга БВМ, аУЗИ, аСМС и внеклеточной ДНК и комбинированных диагностических хромосом, а также тестов ХМА, станет высокоэффективной при выявлении цитогеномных аномалий.