Клиническое применение неинвазивного пренатального обследования – технические и биологические трудности

Введение

В течение последних трех лет неинвазивное пренатальное обследование (НПО) для обнаружения анеуплоидии плода стало клинической реальностью. Клиническое введение было осуществлено благодаря многим валидационным исследованиям, которые были основаны на массовом параллельном секвенировании внеклеточной ДНК материнской плазмы, либо методы таргетного секвенирования (основанные на отборе хромосом, либо на одиночном нуклеотидном полиморфизме (СНИП)).

Был проведен метаанализ недавних клинических валидационных исследований и исследований клинического применения НПО, который обнаружил высокую чувствительность и специфичность для трисомий 21, 18 и 13 хромосом:

  • 99% чувствительность и 99,92% специфичность для трисомии 21 хромосомы;
  • 96,8% чувствительность и 99,85% специфичность для трисомии 18 хромосомы;
  • 92,1% чувствительность и 99,80% специфичность для трисомии 13 хромосомы.

Ложноположительная вероятность для трисомии 21, 18 и 13 хромосом составила 0,08%, 0,15% и 0,20% соответственно. Ряд клинических исследований был исключен из этого анализа, поскольку данные об исходе беременности были недоступны, а другие исследования, в которых также сообщалось о высоких показателях чувствительности и специфичности, были опубликованы.

Ряд профессиональных сообществ, включая Международное сообщество пренатальной диагностики (ISPD), Американскую коллегию акушеров и гинекологов (ACOG) и Королевскую коллегию акушеров и гинекологов (RCOG), выступили с официальным заявлением об использовании НПО для обнаружения трисомии 21 хромосомы, а также и других распространенных аутосомных анеуплоидий (трисомия 18 и 13 хромосом).

Общее мнение заключается в том, что НПО является многообещающей новой технологией, которая имеет большой потенциал в качестве инструмента скрининга для беременных женщин с повышенным риском анеуплоидии у плода. Тем не менее, важно подчеркнуть, что НПО не является диагностическим обследованием в отношении анеуплоидии плода, поэтому положительный результат НПО требует инвазивного обследования для подтверждения результатов. Кроме того, эти сообщества посчитали это недостаточным, чтобы поддержать использование НПО для скрининга населения в целом.

Несколько недавних клинических исследований продемонстрировали сходную чувствительность и специфичность для обнаружения анеуплоидии (преимущественно обнаружения трисомии 21 хромосомы) среди пациентов с ранее установленными высокими или низкими рисками анеуплоидии. Кроме того, результаты при НПО в меньшем количестве являются ложноположительными, чем при традиционных методах оценки риска анеуплоидии. Доля ДНК эмбриона к ДНК матери, то есть процент внеклеточной фетальной ДНК из общего числа образцов внеклеточной ДНК, полученной из материнской плазмы, была сходной в группах высокого и низкого риска.

Однако ожидается, что положительные прогностические показатели будут ниже в группе женщин с низким риском по сравнению с теми, у кого риск анеуплоидии повышен. Положительные прогностические значения для населения в целом также будут зависеть от конкретных характеристик об следования, и дальнейшие исследования оправданы до того, как НПО будет предлагаться всем женщинам на регулярной основе.

Принимая во внимание, что применение НПО было оправданным по причине высокой точности определения трисомии 21, 18 и 13 хромосом плода, в нескольких исследованиях теперь показано, что полногеномный анализ позволяет обнаруживать другие фетальные и, возможно, материнские (мозаичные) анеуплоидии. Такой полногеномный анализ может улучшить ведение беременности и снизить технические и биологические факторы, которые могут отрицательно повлиять на точность обследования.

В этом обзоре мы обсудим клинические преимущества и трудности, связанные с полногеномным анализом свободноциркулирующей фетальной ДНК.

Нестандартный способ проведения скрининга анеуплоидии

Несколько групп продемонстрировали возможность обнаружения всех хромосомных анеуплоидий плода, сегментных дисбалансов и даже субмикроскопических перестроек путем секвенирования внеклеточной фетальной ДНК из материнской плазмы. Несмотря на обещание обнаружить другие анеуплоидии плода, которые могут помочь в интерпретации развития плода, клиническое применение полногеномного анализа НПО в обычных клинических условиях остается ограниченным.

В проспективной серии клинических случаев 1982 года Лау и соавторы обнаружили 7 случаев анеуплоидии для хромосом, отличных от 21, 18, 13, X или Y. Сведения о последующем обследовании и исходе беременности были предоставлены для 5 из них, а ОПМ был подтвержден в 4/5. Две из этих беременностей (включая неподтвержденный случай) были осложнены задержкой внутриутробного развития, а роды произошли на 33-34 неделе беременности. В 2 случаях без каких-либо последующих исследований результат УЗИ был нормальным, беременность продолжалась, и ни о каких аномалиях при рождении не сообщалось.

Еще одно недавнее клиническое исследование, включающее 100 000 пациентов, подтвердило обнаружение этих типов патологий, но не дало конкретных цифр или подробностей наблюдения/исхода отдельных случаев.

В Таблице 1 представлен обзор различных анеуплоидий, которые мы обнаружили при полногеномном НПО в выборке из 4000 беременностей (об новленная работа, в которой сообщалось о 1350 беременностях).

Таблица 1. Различные анеуплоидии, обнаруженные во время 4000 НПО. (ОВ – околоплодные воды).

Последующее инвазивное обследование Без последующего наблюдения 9 2 2 1 1   1 (выкидыш) 1     1         13 5 18
Не подтверждено   1 (ОВ)     2 (ОВ) 1 (ОВ)           1 (ОВ) 1 (ОВ) 1 (ОВ) 1 (ОВ) 1 7 8
Подтверждено 29 6a 1б           1в 1 (фетальный мозаицизм)     1     36 3 39
Группа риска Низкийриск 16 5 2 1 1 1   1 1   1 1 2 1 1 23 (46%) 11 (73%) 34 (52%)
Высокийриск 22 4 1   2   1     1           27 (54%) 4 (27%) 31 (48%)
Общее наблюдаемое количество 38 9 3 1 3 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 50 15 65
Тип анеуплоидии Трисомия 21 хромосомы Трисомия 18 хромосомы Трисомия 13 хромосомы Трисомия 1 хромосомы Трисомия 7 хромосомы Трисомия 8 хромосомы Трисомия 9 хромосомы Трисомия 10 хромосомы Трисомия 15 хромосомы Трисомия 16 хромосомы Трисомия 20 хромосомы Трисомия 22 хромосомы Частичная трисомия 18 хромосомы Моносомия 20 хромосомы Моносомия 22 хромосомы Всего (21, 18, 13) Всего (другие хромосомы) ИТОГО

Высокий риск классифицируется как повышенный риск анеуплоидии согласно комбинированному обследованию (<1/300) (21%).
Низкий риск (всего 79%) включает пациентов с повышенным риском анеуплоидии по причине одного только позднего возраста матери (31%), а также направлений по причине беспокойства матери (46%) или предшествующего семейного анамнеза (2%).
а - 1 из этих 6 образцов является нормальным согласно ОВ, а 77% – мозаичными при анализе ВЧК на трисомию 18 хромосомы.
б - 70% мозаичные при анализе ВЧК.
в - Мозаичность трисомии 15 хромосомы и однородительской дисомии 15 хромосомы.

Клиническая ценность отчетности обо всех анеуплоидиях, обнаруженных посредством НПО, особенно в условиях беременности с низким риском, является спорной, так как это может привести к увеличению инвазивных процедур среди женщин, для которых они обычно не рассматриваются. Сообщения о трисомии 13 хромосомы после НПО в группе женщин с низким уровнем риска уже подвергалось сомнению по причине низких положительных ожидаемых значений и возможного увеличения количества инвазивных процедур по причине ложноположительных результатов НПО. Важным пониманием истинных анеуплоидий плода, обнаруженных посредством НПО, является тот факт, что анеуплоидия может быть ограничена плацентой. И, следовательно, не может отрицательно влиять на развитие плода. Тем не менее существует риск плацентарной недостаточности и задержки внутриутробного развития по причине аномального плацентарного кариотипа, а также риск возникновения мозаичной анеуплоидии плода и/или однородительской дисомии плода по причине «трисомического спасения».

Аналогичным образом рутинный скрининг на анеуплоидию половых хромосом (АПХ) может иметь сомнительную клиническую ценность, учитывая изменчивость фенотипа индивидуумов, например, моносомию X (Тернера), XXY (Клайнфельтера), XYY и XXX. Причем некоторые из них идентифицируются только во взрослом возрасте у пациентов с бесплодием.

Кроме того, точность обнаружения АПХ существенно ниже, чем обнаружения трисомии 21 хромосомы. Было высказано предположение, что физические аномалии, задержки развития и/или бесплодие требуют анализа на АПХ.

Национальная политика, связанная со скринингом на АПХ, различается по странам, а также по способам дальнейшей консультации и управления. Культурные и социальные факторы играют роль в принятии решений родителями о продолжении или прекращении беременности по причине АПХ, фенотипический исход нельзя предсказать.

Мы считаем, что полногеномный анализ может привести к лучшему клиническому ведению. Однако тщательное рассмотрение политики выдачи заключений имеет важное значение для минимизации увеличения числа инвазивных обследований по причине анеуплоидий, которые ограничены плацентой. Мы предполагаем, что обнаружение анеуплоидии послужит причиной тщательного наблюдения как со стороны акушеров, так и клинических генетиков.

В случае выявления нормального развития при обследовании посредством УЗИ дальнейшие инвазивные действия могут быть необоснованными. В случае аномальной картины развития плода, ее можно оценить в свете результатов НПО и УЗИ. Необходимы дальнейшие исследования для оценки исходов таких беременностей. В конечном итоге они позволят разработать правила для лучших клинических последующих мер, которые должны быть приняты.

Обнаружение ВЧК (вариации числа копий) плода

В настоящее время инвазивная пренатальная генетическая диагностика методом традиционного определения кариотипа все чаще заменяется хромосомным микроматричным анализом, позволяющим выявлять субмикроскопические ВЧК. Несколько исследований пренатального хромосомного микроматричного анализа оценили остаточный риск патогенной ВЧК в отсутствие каких-либо серьезных аномалий УЗИ между 0,5% и 1,7%.

Субмикроскопические ВЧК могут быть причиной серьезных нарушения развития у детей, которые могут не проявлять никаких признаков при обычном обследовании УЗИ. Нынешние преобладающие подходы к НПО, ориентированные только на обнаружение общих аутосомных анеуплоидий и анеуплоидий половых хромосом, не обнаруживают других дисбалансов, присутствующих на оставшихся хромосомах. Частота хромосомных аномалий, которые были бы упущены, если бы инвазивный пренатальный хромосомный микроматричный анализ был заменен целевым НПО, была оценена в 16,9%. Данная цифра включает 2% из тех беременностей, риск анеуплоидии в которых оценивался как высокий на основании аномальных результатов скрининга сыворотки.

По причине клинической значимости сегментных анеуплоидий несколько групп изучают аналитические методы увеличения разрешения, достигаемого посредством НПО, для которого была проведена экспериментальная проверка концепции. Некоторые коммерческие поставщики услуг НПО (в том числе компании «Sequenom» и «Natera») начали предлагать дополнительное обследование для выявления небольшого числа синдромов микроделеции и других аутосомных анеуплоидий.

Один коммерческий поставщик услуг (компания «Natera») недавно продемонстрировал экспериментальную проверку концепции и последующее валидационное исследование своего целевого анализа НПО, основанного на СНИП, с включением небольшого числа микроделеционных синдромов (включая 1p36, Синдром кошачьего крика, Ди Джорджи, Вольфа-Хиршхорна, Прадера-Вилли, Ангельмана, Миллера-Дикера и Фелана-МакДермида). Другой (компания «Sequenom») – опубликовал валидацию полногеномного обнаружения ВЧК плода.

Однако проспективные клинические результаты еще не опубликованы, а исследования по точности, специфичности и чувствительности обследования отсутствуют, поэтому их коммерческие предложения несколько преждевременны.

Биологические источники ложноположительных и ложноотрицательных результатов НПО

Плацентарный мозаицизм

Источник внеклеточной фетальной ДНК, как было показано, имеет плацентарное происхождение. Он хорошо задокументирован, исходя из традиционного цитогенетического исследования ткани ВЧК, где происходит ограниченный плацентарный мозаицизм. В нём плацентарная ткань содержит аномальную клеточную линию, которая отсутствует при последующем обследовании (амниоцентезе или обследовании другого фетального материала).

Данный ограниченный плацентарный мозаицизм (ОПМ) наблюдается примерно в 1% инвазивных обследований. Поэтому можно ожидать, что вероятность дискордантных результатов, вызванная ОПМ, наблюдаемым при традиционном цитогенетическом анализе ВЧК и амниоцентезе, будет одинаковой для результатов НПО и амниоцентеза.

Истоки и типы ОПМ подробно описаны ниже, поскольку это важный биологический источник «ложноположительных» результатов НПО, которые невозможно преодолеть техническими улучшениями (мы ссылаемся на книгу «Хромосомные аномалии и генетическое консультирование» Гарднера и Сузерланда для получения дополнительной информации об ОПМ).

Митотический и мейотический ОПМ

Митотический ОПМ возникает из нормальной диплоидной зиготы, после постзиготической ошибки в последовательности клеточных поколений в плаценте. Это обычно приводит к локализованным областям трисомии плаценты и низким уровням мозаицизма при цитогенетическом исследовании. Напротив, мейотический ОПМ возникает из трисомной зиготы, в которой произошло «трисомическое спасение» во время раннего развития плода. Как правило, плод диплоидный, а плацента демонстрирует высокие уровни мозаицизма или полную анеуплоидию.

Тем не менее, существует риск мозаицизма у плода, зависящего от того, когда происходит потеря трисомной хромосомы. Кроме того, существует риск однородительской дисомии плода после «трисомического спасения», зависящего от того, какая хромосома потеряна. Побочное воздействие однородительской дисомии на развитие плода может быть связано с наличием импринтинговых генов или гомозиготных мутаций данной хромосомы.

Различные типы ОПМ: тип I, тип II, тип III

ОПМ далее относится к одному из трех типов в зависимости от конкретной последовательности клеточных поколений, затронутой аномальной клеточной линией. Аномальная клеточная линия может быть ограничена трофобластом (тип I, наблюдаемый при непосредственной ВЧК и молодой культуре), хориальной стромой/мезенхимальным ядром (тип II, наблюдаемый при долговременной культуре) или обеими этими последовательностями клеточных поколений плаценты (тип III).

Типы I и II обычно имеют митотическое происхождение, тогда как тип III преимущественно мейотический по происхождению. Тип I ОПМ связан с повышенным риском спонтанного аборта, внутриутробной гибелью плода, ЗВУР и перинатальными осложнениями. Тип II ОПМ обычно связан с нормальным исходом беременности, при этом ЗВУР и потеря беременности являются нечастыми. Тип III ОПМ обычно связан с внутриутробной гибелью плода или ЗВУР, причем значительная доля связана с мозаичной трисомией 16-й хромосомы.

Обратите внимание, что внеклеточная фетальная ДНК образуется из трофобластов, и, следовательно, при НПО могут быть выявлены только ошибки типа I и типа III. Крупномасштабные европейские и американские исследования ВЧК показали, что хромосомы, участвующие в различных типах наблюдаемых ОПМ, связаны не случайным образом.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты НПО по причине ОПМ

Неудивительно, что в наши дни сообщается о многочисленных случаях
«ложноположительных» результатов НПО по причине ОПМ, и эти результаты могут иметь клиническое значение, связанное, например, с ЗВУР. Существует также возможность однородительской дисомии у плода после «трисомического спасения» на ранней стадии эмбрионального развития.

Риск однородительской дисомии после пренатального обнаружения мозаицизма для трисомии 15-й хромосомы оценивается в 11-25%. Мы сообщили о случае, когда плод имел однородительскую дисомию по хромосоме 15. Сообщается также о случае однородительской дисомии 21-й хромосомы по причине «трисомического спасения» после получения расходящихся результатов НПО и определения кариотипа плода.

Учитывая потенциал для однородительской дисомии, может быть целесообразным следить за расходящимися результатами НПО и результатами инвазивного обследования с обследованием на однородительскую дисомию,  в частности, касательно хромосом с хорошо охарактеризованными импринтинговыми синдромами, в том числе:

  • однородительская дисомия по линии отца (6) – преходящий неонатальный диабет (TND; OMIM №601410);
  • однородительская дисомия по линии матери (7) – синдром Рассела-Сильвера (SRS; OMIM №180860);
  • сегментальная однородительская дисомия по линии отца (11) – синдром Беквита-Видеманна (BWS; OMIM №130650);
  • однородительская дисомия по линии матери (14) – синдром Тэмпла (TS; OMIM №605636 и №176270);
  • однородительская дисомия по линии отца (14) – синдром однородительской дисомии по линии отца (14) (OMIM №608149);
  • однородительская дисомия по линии матери (15) – синдром Прадера-Вилли (PWS; OMIM №176270);
  • однородительская дисомия по линии отца (15) – синдром Ангельмана (AS; OMIM №105830).

Возможность ОПМ означает, что амниоцентез является предпочтительным методом выборки для последующего подтверждающего инвазивного обследования после положительного результата НПО, чтобы исключить ОПМ. Поскольку циркулирующая внеклеточная фетальная ДНК получена из ткани плаценты, ожидается, что результаты НПО будут в значительной степени соответствовать ВЧК. Однако амниоцентез отражает истинный генотип плода. Это подчеркивает его важность для проведения инвазивного повторного обследования, чтобы подтвердить положительный результат НПО. Любое решение о прекращении беременности не должно основываться только на положительных результатах НПО.

Многоплодная беременность

Было продемонстрировано, что НПО может использоваться для выявления анеуплоидии при беременностях двойней. Было показано, что количество внеклеточной фетальной ДНК выше при беременности двойней по сравнению с одноплодной беременностью. Зиготность можно определить путем секвенирования ДНК материнской плазмы, и, следовательно, при дизиготной беременности может быть оценена доля ДНК эмбриона к ДНК матери каждого из близнецов. Однако точность может быть не такой высокой, как при одноплодной беременности.

Одной из возможных биологических причин неточных результатов НПО может быть наличие «исчезающего близнеца». Сообщалось о случаях ложноположительных результатов НПО, в которых можно было подтвердить наличие исчезающего близнеца. Кроме того, Курнов и соавторы оценили теоретическую частоту случаев исчезающего близнеца с хромосомной аномалией примерно в 0,11%, что соответствует ложноположительным показателям вероятности, указанным в метаанализе НПО. Это подчеркивает важность детального ультразвукового обследования, особенно после расходящихся результатов НПО.

Материнские ВЧК

НПО опирается на анализ внеклеточной ДНК, полученной из материнской плазмы, и большая часть внеклеточной ДНК является материнской по происхождению, что может осложнить анализ и интерпретацию результатов НПО. На статистику подсчета традиционных методов стандартизованной оценки полнохромосомного анализа могут влиять материнские ВЧК, приводящие к ложноположительным и ложноотрицательным результатам НПО.

Разработка и клиническое применение аналитических портфелей разработок, которые позволяют дифференцировать локализованные и полнохромосомные события, в том числе, например, материнские ВЧК, помогут избежать таких ошибок. Ван и соавторы сообщили, что 2/25 аномалии половых хромосом, обнаруженные посредством НПО, определены как ложноположительные по причине ВЧК материнской Х-хромосомы.

Другое недавнее исследование показало, что материнские ВЧК были основным фактором, способствующим ложноположительным и ложноотрицательным результатам НПО, а также мозаицизму плода/плаценты. Эти данные демонстрируют важность дифференциации между полнохромосомными и субхромосомными патологиями, а также теми, которые имеют материнское происхождение.

Материнский мозаицизм

Материнский мозаицизм также может быть источником ложноположительных результатов. Цитогенетические исследования показали, что частота потери Х-хромосомы в клетках крови растет с увеличением возраста женщины. Это может быть источником ложноположительных результатов моносомии X-хромосомы, полученных посредством НПО. Ван и соавторы обнаружили, что 8,6% результатов НПО, положительных на анеуплоидию половых хромосом, были связаны с материнским мозаицизмом.

Недиагностированный мозаицизм у матери в отношении других хромосом (или сегментов хромосом) также может быть источником ложноположительных результатов НПО. Мы обнаружили явную сегментарную потерю хромосомы 13 посредством НПО, но впоследствии было продемонстрировано, что она присутствует в мозаичной форме в лейкоцитах материнской крови и отсутствует у плода (Рисунок 1).

Спорно, следует ли проводить цитогенетический анализ материнских клеток для всех положительных случаев НПО, но это может быть целесообразным в некоторых случаях, чтобы избежать ненужных инвазивных процедур, и, безусловно, рекомендуется в ходе последующего наблюдения расходящегося НПО и инвазивных обследований.

(а) НПО для хромосомы 13. При обычном анализе стандартизованной оценки это можно было бы назвать моносомией 13-й хромосомы. Полногеномный анализ идентифицирует это как частичный дисбаланс. Анализ глубины прочтения предполагает, что этот дисбаланс является событием со стороны матери.

(б) Матриксная сравнительная геномная гибридизация 13-й хромосомы, полученная из ДНК, извлеченной из лейкоцитов материнской крови. Хромосома 13 показана вверху, результат матрицы ниже, изображенный геномным положением по оси Х и сигнальным логарифмическим соотношением по оси У, а удаленная область выделена. Среднее отклонение наблюдаемого коэффициента интенсивности сигнала составляет
-0,17, что согласуется с мозаицизмом на уровне ~17%. Микроматричный анализ ДНК, взятого их околоплодных вод, показал, что плод является нормальным (данные не показаны).

(с) Показывает результат метафазной флуоресцентной гибридизации insitu с использованием зондов для 13q теломеры в красном [TelVysion13q(Vysis)] и 13q14 в зеленом [LSI13q14 (Vysis)], показывающих аномальную клетку, которая подтверждает наличие делеции у матери. Эта делеция наблюдалась в 22% проанализированных клеток (66/300 клеток), подтверждающих мозаичность удаленной области. Флуоресцентная гибридизация insituклеток околоплодных вод у плода была нормальной (данные не показаны).

Опухоль у матери

Другим потенциальным источником аномального хромосомного набора во внеклеточной ДНК, полученной от матери, является апоптоз опухолевых клеток материнского происхождения. Впоследствии были выявлены случаи ошибочных результатов НПО, вызванных злокачественными новообразованиями. Использование полногеномного профилирования может потенциально выявлять опухолевидные полногеномные профили анеуплоидии и, следовательно, идентифицировать предсимптоматические раковые образования у беременных женщин.

Материнские причины ложноположительных результатов НПО также подчеркивают важность генетического консультирования до и после обследования. Необходимо заранее сообщить пациентам о том, будут ли они позже информированы о случайных обнаружениях.

Будущая перспектива

В ближайшие несколько лет будет наблюдаться дальнейшее широкое внедрение НПО, что приведет к резкому сокращению инвазивной выборки для проведения пренатальных генетических диагностических обследований во многих странах. С уменьшением затрат технологическими и алгоритмическими достижениями разрешение и объем анализа будут увеличиваться в геномном содержании и разрешении. Мы предполагаем, что полногеномное профилирование улучшит общее ведение беременности.

При снижении затрат на секвенирование будет достигнута его увеличенная глубина. Таким образом, повышается точность обнаружения меньших дисбалансов, что в конечном итоге позволит разрешить анализ текущей матрицы. Несколько групп продемонстрировали экспериментальную проверку концепции стоимости неинвазивного анализа общего генома плода, которая останется непомерно высокой в ближайшем будущем. Это ставит вопрос о том, какое разрешение является достижимым (при сохранении высокой точности) и желательным (пациент и врач). В каких регионах те же проблемы, что и при введении пренатального микроматричного анализа и секвенирования экзома/ генома, возникают в целях улучшения, детального исследования, отчетности.