Современные концепции неинвазивного пренатального скрининга (НИПС)

Неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС, NIPS) иллюстрирует значительный прогресс, произошедший в пренатальном скрининге для трисомий 21 и других хромосомных аберраций. Важно, чтобы медицинское сообщество постоянно было в курсе существующих и потенциальных проблем, чтобы обеспечить актуальной информацией пользователей, которые проходят или назначают такие тесты, как НИПС.

В этом обзоре предлагается наметить и объяснить некоторые из основных текущих вопросов в отношении НИПС и заглянуть в будущее в целях лучшего понимания и аргументированного обсуждения.

Введение

Неинвазивный пренатальный скрининг, разработанный как более точный скрининг-тест для трисомий 21, 13 и 18, доступен уже несколько лет. Одним из основных преимуществ НИПС является его сильная положительная прогностическая ценность (PPV) в отношении трисомии 21, наиболее распространенной хромосомной анеуплоидии с частотой встречаемости, равной 14,2 на 10000. При отсутствии скрининга показатель распространенности в течение 20-ти недель оценивался в пределах от 13 до 10 000 и 35 на 10000.

Традиционный скрининг с использованием комбинированного подхода первого триместра дает PPV менее 4%, а это означает, что более 96% женщин, имеющих высокий риск трисомии 21, будут иметь здорового ребенка. Снижение количества ложноположительных результатов позволит сберечь душевное спокойствие пациентов и уменьшить число инвазивных процедур, таких как амниоцентез. Помимо высокой специфичности в 99,9%, НИПС также имеет превосходный показатель выявляемости: с помощью технологий НИПС детектируется более 99% из случаев беременностей с синдромом Дауна против 78,9%, обнаруженными комбинированным скринингом первого триместра.

Начиная с первых широкомасштабных клинических испытаний НИПС в 2011 году, было внедрено много нововведений и дополнений, направленных на увеличение количества выполняемых тестов и совершенствование методов его проведения. Несмотря на то, что новые тесты регулярно появляются на рынке, они используют аналогичный метод оценки риска хромосомных аномалий, обычно называемый «подсчет».

На сегодняшний день в клинике доступен только один совершенно новый метод, который анализирует полиморфизмы одиночных нуклеотидов (SNP) для оценки риска анеуплоидии. В дополнение к оценке вероятности наличия анеуплоидии целой хромосомы ряд производителей утверждает, что их тесты способны детектировать широкий спектр микроскопических и субмикроскопических делеций и дупликаций. Вполне вероятно, что попытки получить дополнительную информацию о наличии подобных аберраций через пренатальный скрининг продолжатся.

Будущие цели, вероятно, включают скрининг на моногенные заболевания и даже секвенирование полного генома. Подобные модификации пренатального скрининга позволят не только получить детальную информацию, но и ставят перед сообществом ряд технических и этических вопросов, которые необходимо решить.

Будет ли НИПС считаться диагностическим тестом?

Высокая чувствительность и специфичность НИПС некорректно побудили некоторых поставщиков полагать, что тесты НИПС являются диагностическими или «фактически» диагностическими. Это неверное предположение.

Одна из важных причин этого заключается в том, что свободноциркулирующая ДНК (сцДНК), анализируемая с помощью НИПС, происходит из плаценты, преимущественно цитотрофобласта. У большинства беременностей хромосомный состав плаценты идентичен хромосомному составу плода. Однако в небольшом проценте случаев мутация произошла после того момента, когда клетки, предназначенные развиться в плод, отделены от клеток, предназначенных для того, чтобы стать плацентой.

Подобные случаи называют «ограниченный плацентарный мозаицизм» или «ограниченный эмбриональный мозаицизм», в зависимости от местоположения мозаичных клеток. При анализе образцов ворсин хориона исследователи фактически также анализируют плаценту. И всё же это считается диагностическим тестом, что может вызвать вопросы, однако анализ ворсин хориона обычно позволяет оценить два разных клеточных слоя из плаценты (цитотрофобласт и мезенхиму), увеличивая возможность обнаружения мозаицизма.

Установлено, что соответствие между клетками плода и плаценты, проанализированными после клеточной культуры (мезенхимальные клетки), намного выше, чем результаты, полученные после анализа цитотрофобласта, и что какие-либо решения о ведении беременности не должны приниматься на основе оценки только лишь цитотрофобласта. Таким образом, результаты НИПС с высоким риском требуют подтверждения референсным методом до принятия решения о прерывании беременности.

Другие причины ложных результатов по НИПС включают в себя наличие сцДНК от «исчезающего близнеца» или аномалий кариотипа у матери, принимаемые при НИПС за хромосомные аберрации плода. Подобные случаи являются причиной ложноположительных результатов, и они более вероятны в случаях, когда используется методология подсчета, а не подход на основе SNP (подробнее см. ниже).

Все тесты NIPS одинаковы?

Принципиально существует два основных подхода к НИПС. Первый метод, который стал доступным в 2011 году, можно назвать «подсчет». Этот метод оценивает общее количество сцДНК (cfDNA), которая находится в образце материнской плазмы, и оценивает степень представленности интересующих исследователя хромосом, относительно эталонных хромосом. Наблюдаемое соотношение между этими хромосомами сравнивается с ожидаемым соотношением. И если обнаружено большее количество прочтений, картированных на хромосому, чем ожидалось, предполагается, что она является плодной по происхождению. И можно сделать вывод о «высоком риске» или «положительном» результате.

Этот метод обычно эффективен для обнаружения трисомий целых хромосом, но методология имеет некоторые ограничения. Поскольку в случае оценки представленности хромосомы не проводятся различия между плацентарной и материнской ДНК, данная технология не в состоянии идентифицировать ограничения, которые могут привести к ложным результатам. Одним из таких ограничений является феномен исчезающего близнеца. Данное явление детектируется в 27-41% случаев беременностей, где на ультразвуке были идентифицированы два плода.

ДНК исчезающего близнеца может циркулировать в крови в течение, по крайней мере, 8-ми недель после спонтанной редукции плода и может привести к ложным результатам, поскольку эта сцДНК также будет учитываться вместе с сцДНК от здорового плода.
Во-вторых, хромосомные аберрации кариотипа матери также могут привести к ложным результатам.

Изучение высокого риска дискордантности аномалии половых хромосом, проведенных с помощью обсуждаемого метода, продемонстрировало, что 8,6% из них были в действительности из-за аномального материнского кариотипа. Общепризнанно, что у ряда женщин подвергаются потере Х-хромосомы в определенной пропорции клеток с возрастом.

Мозаицизм невозможно детектировать, используя НИПС на основе оценки представленности каждой хромосомы, который учитывает всю анализируемую сцДНК. Наконец, методы подсчета неспособны обнаружить триплоидию, поскольку они полагаются на поиск разницы в соотношениях между интересующей хромосомой и контрольной хромосомой. Если представлены три копии всех хромосом, как в триплоидии, нет никакого изменения соотношения, и высока вероятность получить ложноотрицательный результат.

Недавно разработанный метод проведения НИПС, коммерчески доступный с 2013 года, использует оценку однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) для идентификации плодной фракции сцДНК в общем пуле сцДНК. SNP представляют собой вариации одиночных оснований в последовательности ДНК, которые часто встречаются в популяции.

Путем секвенирования более 13 000 SNP, расположенных на 5 хромосомах (21, 13, 18, X и Y), проводится оценка коэффициентов аллелей на каждом участке SNP, а передовые биоинформатические инструменты используются для определения вероятности наличия в данном случае беременности вариации числа копий с участием одной из этих хромосом. Это определение позволяет вычислить вероятность того, что у плода трисомия 21, 13, 18 или моносомия X. Соотношение материнского аллеля оценивается с целью его исключения из анализа. СцДНК, появившаяся от дополнительного источника, такого как исчезающий близнец, также может быть идентифицирован, не будет интерпретирован как анеуплоидия и позволит избежать выдачи ложных результатов. Метод SNP также может идентифицировать триплоидии и родителя происхождения.

Фетальная фракция

Фетальная фракция считается самым важным фактором для точного анализа НИПС. Фетальная фракция – это доля плацентарной (а не материнской) ДНК от общей ДНК в образце плазмы, выраженная в процентах. В течение периода, во время которого обычно выполняется НИПС, средняя величина фетальной фракции составляет 10-12%. Если фетальная фракция слишком низкая, становится трудно точно отличить дисомию от трисомии у плода,  и именно низкая фетальная фракция считается основной причиной нескольких ложноотрицательных результатов НИПС.

До недавнего времени многие НИПС-лаборатории не измеряли фетальную фракцию. ACMG в своем заявлении 2016 года утверждал, что фетальную фракцию следует измерять и фиксировать при проведении НИПС.

Фетальная фракция может быть измерена несколькими способами. Один из методов предполагает оценку наличия материала из Y-хромосомы. Несмотря на эффективность данного метода для определения фетальной фракции плодов мужского пола, он не может быть использован для плодов женского пола. Поэтому этот метод не должен быть единственным.

Некоторые методы работают для плодов как мужского, так и женского пола, но являются косвенными подходами, использующими характеристики, которые различаются в зависимости от происхождения ДНК. Например, для оценки фетальной фракции используется средняя длина фрагментов ДНК в образце (фрагменты плода в среднем короче, чем фрагменты материнского происхождения), так как имеет место метилирование (фрагменты плода более вероятно будут метилированы, чем материнские).

Использование SNP для разделения ДНК эмбриона и материнской ДНК позволяет более точно оценивать долю ДНК, имеющую плацентарное происхождение. Метод SNP работает одинаково хорошо для плодов как мужского, так и женского пола, и кроме того он учитывает точный различающий фактор между материнской и эмбриональной ДНК – наличие аллелей отцовского происхождения.

Факторы, влияющие на фетальную фракцию

Известно, что ряд факторов влияет на фетальную фракцию. Фетальная фракция изменяется с гестационным возрастом (её величина увеличивается на протяжение всей беременности, но остается стабильной между 12-й и 17-й неделями).

Ожирение у матери связано с более низкой фракцией плода. Считается, что это обусловлено эффектом разбавления, связанным с увеличенным вкладом cfDNA из материнских адипоцитов. Другие материнские факторы, например, гипертония, также могут снизить фетальную фракцию.

Важно отметить, что низкая фетальная фракция ассоциирована с повышенным риском анеуплоидии, в частности, трисомии 13 и 18. По этой причине ACMG рекомендовал предлагать диагностическое тестирование пациентам, которые не могут получить результаты НИПС из-за низкого уровня фетальной фракции.

Использование технологий: в каких случаях обосновано выполнение НИПС?

Может ли НИПС заменить скрининг первого триместра?

Первичный скрининг обычно представляет собой комбинацию ультразвука для оценки затылочной прозрачности и тест сыворотки крови для оценки уровней PAPP-A и б-ХГЧ. Скрининг первого триместра может подтвердить наличие живого плода, исключить наличие двух и более плодов (или, если они присутствуют, определить хорионичность) и может определить структурные дефекты, такие как анэнцефалия, а также измерить затылочную прозрачность.

Сыворотка нужна не только для скрининга на трисомию 21, 13 и 18, но также для определения расщепления позвоночника. НИПС же ориентирован на скрининг хромосомных аномалий. Таким образом, он не заменяет скрининг первого триместра. Для оценки нехромосомных аспектов НИПС следует интегрировать в программу, которая включает также ультрасонографию и выявление расщепления позвоночника.

Скрининг для трисомии 21

Так как трисомия 21 является наиболее распространенным хромосомным расстройством и наиболее частой причиной расстройств обучения, трисомия 21 является основным направлением пренатального скрининга. Комбинированный тест первого триместра включает скрининг сыворотки матери и измерение затылочной прозрачности, чтобы дать оценку риска трисомии 21, и может обнаруживать приблизительно 80% случаев трисомии
Однако специфичность этого скрининга очень невелика, и только около 4% случаев «высокого риска», выявленных данным методом, действительно будут с трисомией 21.

До введения НИПС, когда женщины получали в результате скрининга первого триместра результаты с высоким риском, единственным вариантом было предложение инвазивного тестирования. Однако, этот вариант несет риск выкидыша, который, даже будучи невысоким, достаточен, чтобы вызвать у некоторых женщин отказ от продолжения тестирования, особенно учитывая, что у большинства на самом деле не будет трисомии.

НИПС гораздо более специфичен. Проведение НИПС для женщин с выявленным в результате скрининга первого триместра высоким риском трисомии значительно уменьшает количество ложноположительных результатов для трисомии 21. Однако, одним из преимуществ НИПС является то, что он также более чувствителен к выявлению трисомии 21, чем комбинированные сывороточные скрининговые тесты, с процентом выявляемости более 99%. Если НИПС используется в качестве повторного скринингового теста для трисомии 21, эта дополнительная чувствительность теряется.

Расширение подхода для выявления других геномных нарушений

Одним из недостатков НИПС является его направленность на обнаружение определенных генетических отклонений, неспособность выявить ряд других нарушений, которые могли бы быть найдены с помощью первоначально использовавшихся инвазивных методов, проводившихся на первом триместре беременности, для определения риска развития наследственных отклонений. Это иногда подтверждается тем, что у женщин, для которых в результате комбинированного скрининга на первом триместре был поставлен диагноз высокий риск аномалий, в некоторых случаях были затем обнаружены хромосомные отклонения плода, что не было замечено при НИПС, но к счастью было зафиксировано при кариотипировании или хромосомном микроматричном анализе (ХМА) при амниоцентезе или взятии пробы ворсин хориона.

При отсутствии отклонений на УЗИ в 0,1% случаев беременностей были выявлены отклонения путем исследования кариотипа. Большинство хромосомных аномалий, не ассоциированных со структурными нарушениями плода, меньше 5-7 миллионов пар оснований, что является нижней границей детектирования нарушений в кариотипе.

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА), позволяющий выявить наименьшие делеции и дупликации в хромосомном материале, но не единичные генные мутации, дает клинически статистически значимые результаты по обнаружению генетических аномалий в 1,7% случаях беременностей при не выявлении отклонений путем ультразвукового исследования. Тем не менее, в настоящее время ХМА предлагается не всем женщинам с выявленным высоким риском генетических отклонений у плода без показаний аномалий на УЗИ. Только те пациентки, которым предложили сделать ХМА при проведении инвазивного теста, получили пользу от обнаружения субмикроскопических делеций или дупликаций, полученных в результате прохождения комбинированного скрининга первого триместра.

Замечания, наблюдаемые из-за специфической направленности НИПС, могут быть частично учтены при расширении рамок исследования с сохранением повышенной чувствительности и специфичности к распространенным трисомиям, но с возможностью выбрать из широкого спектра дополнительных условий. В настоящее время предлагаемые варианты включают тесты: те, что выявляют специфические микроделеции, и те, в которых предлагают геномное сканирование на большие делеции и дупликации.

Ориентирование на определенные мутации позволяет обнаружить клинически значимые синдромы, такие как расстройство, возникающее в результате делеции 22q11.2 – наиболее распространенной среди людей микроделеции. В недавних исследованиях было показано, что частота выявления данного синдрома составляет 1 к 1000. В отличие от трисомий, риск возникновения нарушений не зависит от возраста матери. В связи с чем для молодых женщин вероятность родить ребенка с микроделецией выше, чем с синдромом Дауна.

Другой возможный вариант исследования – полногеномное сканирование на крупные делеции и дупликации. На сегодняшний день доступны такого рода тесты, позволяющие обнаружить делеции или дупликации, большие или равные 7 миллионам пар оснований, сходного размера с теми, что можно выявить при стандартном кариотипировании.

Сколько исследований необходимо провести?

Количество аномалий, которые можно пренатально детектировать, увеличивается, в связи с чем возникает обеспокоенность о возможных негативных последствиях их проведения. При этом трисомии по 21, 13, и 18 хромосомам хорошо изучены, и существует большой объем информации для осведомления родителей о возможных исходах, но это не так для большого числа пренатально детектируемых аномалий.

При хромосомном микроматричном анализе обнаруживается огромное количество вариаций числа копий (делеций или дупликаций хромосомного материала), значимость которых не определена. Такие аномалии называются «варианты с неопределенной значимостью» (ВСНЗ). Это пренатальное определение ВСНЗ приводит родителей и врачей в затруднительное положение: нарушение было выявлено, но предсказать исход его влияния на развитие плода сложно. Некоторые хромосомные аномалии, которые возможно пренатально детектировать, ассоциированы с известными заболеваниями, но условия могут быть настолько уникальными, что четко проинформировать родителей невозможно.

Другие пренатально детектируемые хромосомные изменения могут быть ассоциированы со смертью плода во время беременности или в основном несовместимы с жизнью, такие как редкие или часто наследуемые аутосомные трисомии с различной степенью значимости для развития плода. Это является доводом к проведению полногеномных исследований, но при некоторых условиях они могут быть менее информативными. Однако некоторые родители могут изъявлять желание владеть этой информацией.

Применение расширенного НИПС вызывает ряд проблем:

  1. Маленькие делеции и дупликации сложнее обнаружить, и каждая в отдельности реже встречается, поэтому уровни ложноположительных и ложноотрицательных результатов выше, чем для распространенных трисомий.
  2. Несмотря на то, что большое количество делеций и дупликаций  с клинической значимостью может быть выявлено, остаются те, для которых степень патогенности не ясна. Обнаружение хромосомных нарушений с неопределенной значимостью в течение беременности приводит к серьезным проблемам в информировании пациентов. Использование таргетных тестов может ограничить выявление таких ВСНЗ, так как будет осуществляться поиск только известных генетических аномалий.

ACMG советует информировать всех беременных женщин о доступности исследований с клинически значимыми результатами и о возможных исходах, обсуждать это с пациентом вне зависимости от того, хотят они пренатальные тесты или диагностические. В то же время ACMG не поддерживает проведение полногеномных исследований в рамках НИПС, советуя проводить инвазивные диагностические тесты для женщин, которым необходимо получить более релевантную информацию.

Перспективы

По мере совершенствования технологий, вероятно, будет предложено еще больше подробных пренатальных скрининг-тестов, которые включат в себя диагностику моногенных заболеваний и возможность обнаружения вариаций числа копий генов, что, в конечном счете, позволит проводить секвенирование полного генома на неинвазивной основе.

Безусловно, важен ряд этических вопросов. Секвенирование полного генома определяет не только факторы, влияющие на пренатальный период. Секвенирование способно обнаружить дефекты, которые проявятся гораздо позже, во взрослой жизни. Существует мнение, согласно которому массив информации, основанный лишь на пренатальных исследованиях, в отдельных случаях не принесет пользы, а напротив – помешает самостоятельному принятию решения.

Принимая во внимание вышеизложенные аспекты, мы должны понять:

  1. Какой тип информации действительно значим и этически допустим в рамках пренатальной диагностики.
  2. Каким образом преподносить информацию будущим родителям, чтобы те имели возможность принять взвешенное решение по поводу получения необходимого объема информации, собранной   в ходе беременности.

Заключение

Неинвазивный пренатальный скрининг – это важное достижение в области пренатальной диагностики не только из-за потенциально большей чувствительности и специфичности анализа трисомии по 21 хромосоме (по сравнению с общим скринингом трисомии в первом триместре), но и благодаря возможности проведения наиболее информативного исследования.

Важным аспектом остается нахождение компромисса между недостатками и преимуществами технологии скрининга. Это поможет будущим родителям принять взвешенное и объективное решение относительно своего пренатального здоровья. Не менее важным нюансом является профессионализм медицинского работника. Он должен понимать все возможности этого специфического исследования и располагать всеми необходимыми данными, на которых основан анализ, вне зависимости от того, какой конкретно тест выбран.

В данное время доступен широкий диапазон вариантов скрининга,    и, безусловно, он продолжит расширяться. По этой причине сохраняется необходимость разработки методов информирования, благодаря которым процесс предоставления необходимой информации станет доступным для всех беременных женщин и их партнеров.